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                        如何區別動物細胞培養基?培養基的分類了解一下!

                        更新時間:2022-10-09   點擊次數:1121次

                        細胞培養基(cell culture medium)是人工模擬動物細胞的體內生長環境,維持體外細胞存活和增殖的營養物質基礎,其主要功能是為細胞提供適宜的pH和滲透壓,以及細胞本身不能合成的各種營養物質。本文將對細胞培養基的種類、成分及理化性質,以及相關問題等方面進行介紹。

                        細胞培養基的種類

                         

                         

                        按照細胞培養基的發展歷史,細胞培養基大致可分為平衡/鹽溶液、天然細胞培養基、合成細胞培養基、無血清細胞培養基、限定化學成分細胞培養基等幾大種類。

                         

                        1.1 平衡/鹽溶液(balanced salt solution,BSS)

                         

                        BSS主要是由無機鹽、葡萄糖組成,它的作用是維持細胞滲透壓平衡,保持pH穩定及提供簡單的營養。其主要用于細胞的漂洗、配制其他試劑等。幾種常用的BSS配方如下(表1-1)。



                        D-Hank's與Hank's的一個主要區別是前者不含有Ca2+和Mg2+,因此D-Hank's常用于配制胰/酶溶液。因為Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成份,參與細胞粘附等功能,使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免細胞結團。此外,Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液,前者緩沖能力較弱,適合于密閉培養;后者緩沖能力較強,適合于5% CO2的培養條件。

                         

                        表1-1  幾種常用的BSS配方(g/L)


                        1.2 天然細胞培養基

                         

                        天然培養基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。其優點是營養成分豐富,培養效果良好,但缺點是成分復雜,來源受限且制作過程復雜、批間差異大。目前廣泛使用的天然培養基是血清,另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必/不可少。

                         

                        水解乳蛋白是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物,含豐富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配制成0.5 %溶液(采用平衡鹽/溶液溶解)與合成培養基(如MEM細胞培養基)以1:1的比例混合使用。

                         

                        目前用于細胞培養的血清主要是牛血清,培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的,但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等,這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。此外,血清含一些對細胞產生毒性的物質,如多胺氧化酶,能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長,甚至造成細胞死亡。目前,血清多作為一種添加成分與合成培養基混合使用,使用濃度一般為5 ~ 20 %,最/常用是10 %。

                         

                        由于水解乳蛋白和血清成份復雜,批間差異大及存在病毒等外源污染風險,對下游生物制品的分離純化和安全性都存在較大的影響,在生物制藥行業的使用也越來越少。因此,基于對血漿成份的分析,合成細胞培養基應運而生。

                         

                        1.3 合成細胞培養基

                         

                        合成培養基是根據天然培養基的成分,用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養基。最早開發的基礎培養基(minimal essential medium, MEM),其本質為含有鹽、氨基酸、維生素和其他必需營養物的pH緩沖的等滲混合物。在此基礎上,DMEM、IMDM 、HAM F12、PRMI1640等各種合成細胞培養基被不斷開發出來。常用合成培養基的配方此處不詳細介紹,其特性及應用的范圍見表1-2。

                         

                        表1-2  常用合成培養基的特性及應用的范圍


                        與天然培養基相比,有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代,因此,細胞培養中使用合成培養基時必須加入一定量的天然培養基成分,以克服合成培養基的不足。最/普遍的做法是添加5 ~ 10 %的血清,這樣才能維持細胞活力,促進細胞增殖。針對不同的動物細胞,現已開發了多種商業化、個性化的低血清細胞培養基配方,營養成份更加豐富,血清使用量可降低至1~3 %,由此可減少了血清等動物來源成份對生物制品安全性的影響。

                         

                        1.4 無血清細胞培養基(serum free medium,SFM)

                         

                        經歷了天然培養基、合成培養基后,無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可降低生產成本,簡化分離純化步驟,避免病毒污染造成的危害。無血清培養基,一般是在合成培養基的基礎上,加入成份*明確的或部分明確的血清替代成份,達到既能滿足動物細胞培養的要求,又能有效克服使用血清所帶來問題的目的。



                        無血清培養基中通常需要添加一些額外的組分,才能幫助細胞貼壁生長,包括以下幾大類物質:

                        1)促貼壁物質:一般為細胞外基質,如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子,對許多細胞的繁殖和分化,起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化,這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

                         

                        2)促生長因子及激素:針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質,有些激素是許多細胞必/不可少的,如胰島素。

                         

                        3)酶抑制劑:培養貼壁生長的細胞,需要用胰/酶消化傳代,在無血清培養基中需含酶抑制劑,以終止酶的消化作用,達到保護細胞的目的。最/常用的是大豆胰/酶抑制劑。

                         

                        4)結合蛋白和轉運蛋白:常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比較大,可增加培養基的粘度,保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

                         

                        5)微量元素:硒是最常見的。

                         

                        1.5 無蛋白無血清細胞培養基與化學組份限定無血清細胞培養基

                         

                        1)無蛋白無血清細胞培養基(protein free midium, PFM)

                         

                        這類培養基*不含有動物來源蛋白,但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段,以及類固醇激素和脂類前體等,以替代動物激素、生長因子的作用。其特點是*沒有蛋白或蛋白含量極低,有利于生物制品的分離純化。

                         

                        2)化學組份限定無血清細胞培養基(Chemically defined media, CDM)

                         

                        此類培養基是目前安全、理想的無血清細胞培養基,所有成份的濃度都*明確,即使其所添加的少量蛋白,也是可經過純化處理,成份明確、濃度確定的蛋白。這類培養基較為理想地減少了生產的可變性,提高了生產工藝的重復性,并有效降低了純化成本。

                         

                        1.6 個性化細胞培養基

                         

                        嚴格意義上來說,個性化細胞培養基不在細胞培養基的傳統分類之列,其具體是指一類根據細胞特性、細胞培養工藝特點、使用者需求習慣而量身定制的細胞培養基,主要目的是提高細胞產率、產品質量、產品安全性和降低血清的使用等。個性化細胞培養基可能是無血清培養基,也可能是低血清培養基,最終是為滿足某一種或某一類生物制品的生產需求。



                        培養基的基本組分

                        細胞培養基必須含有充分的營養物質,才能滿足新細胞合成、細胞代謝等生化反應所需要的物質和能量。細胞培養基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助營養物質等。此外,還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。

                         

                        2.1 水

                         

                        水是細胞的主要成份,也是細胞賴以生存的主要環境。細胞培養液中90 %以上的成份是水。細胞對水的品質非常敏感,水的品質將直接影響細胞培養的效果。而水中通常含有重金屬、氯、磷、有機物、熱原等污染物,細胞培養用水須經過純化,品質應符合中國藥典注射用水標準或者超純水的標準。

                         

                        2.2 能源和碳源

                         

                        能源和碳源是用于維持細胞生命和支持細胞生長,主要包括糖、糖酵解的產物和谷/氨酰胺,其他氨基酸是次要的能源和碳源物質。細胞能夠利用的糖類主要是六碳糖,目前大多體外培養時選取葡萄糖作為細胞的主要碳源和能量來源,因此細胞培養基中基本都含有葡萄糖,含量一般為5~25 mmol/L。

                         

                        在葡萄糖濃度較高時,細胞主要通過擴散作用吸收葡萄糖,細胞膜內外的葡萄糖濃度梯度是細胞吸收葡萄糖的動力;在葡萄糖濃度較低時,主要由鈉離子推動的高親和性轉運過程使細胞攝取葡萄糖。葡萄糖進入細胞后參與糖酵解、核酸代謝、糖原合成、能量代謝以及一些氨基酸的合成。與體內的能量供應途徑不同,體外培養時,一定的濃度范圍條件下,葡萄糖主要經糖酵解循環轉化成乳酸來為細胞提供能量。

                         

                        2.3 氮源(氨基酸)

                         

                        氨基酸在細胞內的重要生理作用主要體現在以下幾個方面:

                         

                        ① 是蛋白質的基本組成單位,用于合成蛋白質和多肽;

                         

                        ② 可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物,如核酸、尼克酰胺等;

                         

                        ③ 某些氨基酸還具有獨/特的生理作用,如甘氨/酸參與生物轉化作用,丙氨/酸和谷氨/酰胺參與細胞內氨的運輸等;

                         

                        ④ 可轉變成糖類和脂肪,參與氧化供能。

                         

                        細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體,D型氨基酸不能被利用。不同的細胞對氨基酸的需求各異,但有些必需氨基酸是細胞不能自身合成的,必須依靠外源的細胞培養液提供。其余非必需氨基酸,細胞可以自己合成,或通過轉氨作用由其他物質轉化而來,但是在細胞培養基中添加適當濃度的非必需氨基酸可以減輕細胞在合成方面的負擔,提高谷氨/酰胺及其它必需氨基酸的利用率。

                         

                        絕大部分細胞對谷氨/酰胺有較高的要求,可能因其不僅是細胞的主要氮源,且可作為細胞生長的能源物質和嘌呤、嘧啶核苷酸的前體,另外還可直接作為細胞增殖和產物合成中的蛋白質和多肽的組成成分。在缺少谷氨/酰胺時,細胞會生長不良,甚至死亡。由于谷氨/酰胺具有多種生理作用,體外動物細胞培養時需要大量谷氨/酰胺,利用量常超過其他必須氨基酸利用量的總和。

                         

                        2.4 維生素

                         

                        維生素是維持細胞生長的生物活性物質,在細胞代謝中起調節及控制作用。維生素可分為水溶性和脂溶性兩類,水溶性/維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉/酸、煙/酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維/生素C、膽/堿、肌醇等;脂溶性維/生素主要包括維生/素A、D、 E、K等;有的培養液中還直接采用ATP和輔/酶A;大部分培養基中還有生/物素。

                         

                        許多維生素參與構成各種酶的活性基團的成分,沒有它們,酶便沒有活性,代謝活動將無法進行。比如,泛酸可以在細胞內轉變成?;d體蛋白和輔酶(如輔/酶A),參與糖類、脂類和蛋白質代謝中的催化反應;維生素B12則在細胞內參與葉/酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的細胞培養基中維生素的濃度有較大差異。例如,DMEM培養基中維生素的含量約為MEM培養基的兩倍,其原因是一方面不同種類維生素的作用不同,另一方面不同種類的細胞對維生素的需求也可能有較大差異,相應細胞培養基的配方中維生素的含量也可能不同。

                         

                        2.5 無機鹽

                         

                        無機鹽是細胞維持生命活動所不可/缺少的營養成分,主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、PO43—、SO42—、HCO3-等,主要作用為維持細胞培養液滲透壓平衡,參與細胞的代謝活動。此外,通過提供鈉,K+和Ca2+,幫助細胞調節細胞膜功能。Na+是細胞外液中最主要的陽離子,對維持滲透壓的恒定有決定性的作用,還與Cl-共同參與生物電活動、維持水平衡和酸堿平衡等。K+主要分布在細胞內液,對于激活某些酶是必需的,并在調節細胞內環境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+和Mg2+主要參與信號傳導、能量代謝、脂肪酸合成、核糖體穩定和蛋白質合成等多種生理作用。PO43-、SO42-、HCO3-是基質所需陰離子,同時是細胞內電荷的調節者。磷對于細胞的生長、代謝和調控都有重要的作用,含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白質是構成細胞的主要成分,ATP、ADP是能量生成、存儲和利用的不可/或缺的化合物。

                         

                        上述離子對于細胞的作用各有不同,它們共同構成了細胞賴以生存的滲透壓、pH和電化學平衡的微環境,細胞對于某種元素的吸收利用會受到其它元素的干擾,例如培養基中過高的鈣離子濃度會使鎂和鋅的吸收利用受到干擾。因此,在保證培養基中上述離子濃度滿足要求以外,還需保證上述離子之間種類和比例的平衡。

                         

                        此外,微量元素如鐵、鈷、鎳、硒、碘、銅、鋅、錳、鉻、鉬、氟等對于細胞生長代謝和產物合成都有促進作用。微量元素在細胞內通常以與有機物結合的形式存在。其中鐵在細胞中參與氧的轉運;鈷是維生素B12的組成部分,參與葉/酸的合成和脂肪酸的合成;鎳能夠激活脫氧核糖核酸酶、乙酰輔酶/A合成酶等在細胞內具有重要功能的酶,還具有穩定核酸結構的功能;亞硒/酸鈉中的硒,作為谷胱/甘肽過氧化物酶的輔基,具有抗過氧化物能力,參與消除細胞內的脂肪酸過氧化物,提高細胞的生長速率和活性。

                         

                        2.6 其他添加成分

                         

                        在低血清、無血清細胞培養基中,為滿足細胞生長增殖需要,常常添加一些成份:蛋白質、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環的中間產物、脂類、及一些血清替代因子等。其中蛋白質具有重要的作用,動物細胞對許多物質(難溶于水的離子或脂類物質)的攝取需要借助蛋白質的傳遞作用,如白蛋白、傳遞蛋白、貼壁蛋白等能夠攜帶脂肪酸、激素、礦物質等促進細胞生長。轉鐵蛋白是一種重要的傳遞蛋白,能夠結合鐵,促進細胞對鐵離子的吸收,并具有解毒作用,其促生長作用可能與其具有生長因子的功能有關。胰島素可促進細胞對葡萄糖和氨基酸的利用,商業化中一些生長因子以重組蛋白形式添加到培養基中,主要用來刺激細胞增殖,并可促進糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一種重要的刺激細胞生長的化合物,是腦磷酸的合成前提。

                         

                        另外,酚紅作為pH值的指示劑被加入到細胞培養基中。酚紅在產物純化過程中會造成干擾,并且具有一定的固醇類激素樣作用,如雌激素樣作用。當用于哺乳類動物細胞的培養,可能會發生一些固醇類反應?,F在商業化細胞培養基中的酚紅含量可根據需求調整。因生物反應器具有pH在線檢測技術,生物反應器培養動物細胞時,酚紅可*去除。

                         

                        2.7 保護劑

                         

                        細胞保護劑是保護細胞免受滲透壓變化、剪切力、氧化及氣泡作用等引起的損傷的物質。在使用生物反應器培養動物細胞時,細胞易被機械攪拌和通氣鼓泡產生的流體剪切力和氣泡作用所傷害甚至破損死亡。為降低這種損傷,除優化生物反應器結構和生產工藝外,可在細胞培養液中添加一些保護劑。其主要是通過改變細胞培養基物性或是對細胞具有保護作用的物質,常用的種類有血清、白蛋白、聚已二醇(PEG)、非離子性表面活性劑PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。

                         

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