質粒提取實驗常見問題分析

　　質粒提取原理

　　現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質粒（＞15Kb）。

　　堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠遠大于質粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質粒為共價閉合環狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環境中，線性的大分子的染色體DNA完quan變性，而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可以恢復其天然構象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA仍在上清中。

　　質粒提取常見問題分析

　　1、影響質粒提取的因素有哪些？

　　質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細菌細胞的裂解、質?？截悢?、質粒的穩定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

　　2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶？

　　革蘭氏陽性菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。

　　3、如何根據實驗需要選擇不同級別的產品？

　　從純度上：各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化，普通純度的質?？梢詽M足要求；而對于轉染實驗，則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。

　　從提取的量上：1-20μg，應選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應選擇大量提取試劑盒。

　　從宿主菌上：分為普通細菌質粒提取試劑盒、G+菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒，根據情況進行選擇。