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    技術支持

    質粒提取實驗常見問題分析

    更新時間:2024-03-08   點擊次數:134次

      質粒提取原理

      現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法,前兩種方法較為劇烈,適用于較小的質粒(<15Kb),而去污劑裂解法則比較溫合,一般用于分子量較大的質粒(>15Kb)。

      堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為:染色體DNA遠遠大于質粒DNA,染色體DNA為線狀分子,而質粒為共價閉合環狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環境中,線性的大分子的染色體DNA完quan變性,而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可以恢復其天然構象,在高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質粒DNA仍為可溶狀態,通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA仍在上清中。

      質粒提取常見問題分析

      1、影響質粒提取的因素有哪些?

      質粒提取的得率和質量與很多因素有關,如宿主菌的種類和培養條件、細菌細胞的裂解、質??截悢?、質粒的穩定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

      2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶?

      革蘭氏陽性菌有一層細胞壁,必須加入溶菌酶才能使之溶解。

      3、如何根據實驗需要選擇不同級別的產品?

      從純度上:各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化,普通純度的質??梢詽M足要求;而對于轉染實驗,則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。

      從提取的量上:1-20μg,應選擇小量提取試劑盒;20-40μg,應選擇中量提取試劑盒;大于40μg,應選擇大量提取試劑盒。

      從宿主菌上:分為普通細菌質粒提取試劑盒、G+菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒,根據情況進行選擇。

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